LncRNA h19在非小细胞肺癌中的表达及对细胞的生物学行为的影响

发布时间：2017-08-05 20:17

  本文关键词：LncRNA h19在非小细胞肺癌中的表达及对细胞的生物学行为的影响

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【摘要】：目的:肺部恶性肿瘤是发病率和死亡率增长最快,对人群健康、生活和生命威害最大的恶性肿瘤之一。根据全国肿瘤登记中心2014年最新研究显示,全国男性肺癌的发病率为(1/105)49.27,在所有恶性肿瘤中位居第一位;女性肺癌的发病率为21.66,在所有恶性肿瘤中位居第二(乳腺癌25.89)。在全国城市中肺癌的发病率和死亡率为20.48和27.05均位居第一位;与此同时,在全国农村中肺癌的发病率和死亡率为18.50和22.42也均位居第一位。随着现在科技的进步以及各为研究者的深入研究,虽然对于肺癌的认识越来越深入,但是在肺癌的防治仍然是我们目前面临的重大难题。好多肺癌患者在出现临床症状的同时就医,大多数已处于中晚期,因此研究肺癌的发病机制,寻找肺癌的分子生物学早期诊断指标,探讨肺癌的治疗靶标,不仅是在临床具有重要的价值,更重要的是对于社会更有积极的意义。肺部恶性肿瘤的从发生到发展是一个逐步积累的过程,一般是由于细胞生长过程中调控紊乱及生长方式的改变,从而引起细胞发生癌前病变及基因改变。肺癌的发生是一个积累性的基因损伤,是一个多步骤、多基因参与的过程,包括原癌基因的激活、抑癌基因的失活、以及表观调控、转录水平调控、转录后水平的紊乱,造成细胞组织器官失去原有的性质及作用对于人体造成损伤。Lnc RNA是以RNA的形式在多种层面上调控基因的表达水平,一般而言,越来越多的研究发现lnc RNAs广泛参与了基因组调节,在肿瘤的发生、发展及转移方面起着重要的作用。虽然长链非编码RNA h19的异常表达与其他肿瘤的发生,包括肝癌、卵巢癌、前列腺癌、大肠癌、乳腺癌,有着密切的关系[1-7],但在非小细胞肺癌中的相关文献尚不多见。因此,本研究旨在研究长链非编码RNA h19在非小细胞肺癌中的异常表达对肺癌高危因素的相关性及对癌细胞的增殖、迁移及侵袭的影响。方法:⑴收集64例手术治疗患者中,术前诊断为非小细胞肺癌并未接受放化疗,术后病理确诊为非小细胞肺癌的患者,切除的新鲜癌组织及对应的癌旁组织;并将组织冰盐水中清洗干净并放入液氮中速冻24小时移至-80℃冰箱保存。⑵q RT-PCR检测64例非小细胞肺癌中h19的表达情况:首先采用Trizol法提取癌组织及正常组织的总RNA;然后利用琼脂糖凝胶电泳进行RNA质量鉴定,确保RNA的完整性;再次设计lnc RNA h19的反转录引物以及相应的上、下游引物,并且根据反转录试剂盒说明书的步骤进行反转录;最后应用q RT-PCR检测长链非编码RNA h19的表达情况。⑶根据各组的表达情况分析其与肺癌高危因素的相关性。⑷选取肺癌细胞株A549进行细胞培养。⑸应用TRIZE方法提取非编码长链RNA;利用琼脂糖凝胶电泳进行对提取的RNA进行质量鉴定;设计lnc RNA h19的反转录引物以及相应的上、下游引物,根据h19基因β-actin基因[8]使用引物设计软件primerprimer5,分别参照Gene Bank所刊登序列设计,以内参基因β-actin基因作为对照;再进行反转录,q RT-PCR来测定细胞株内表达h19的情况。⑹构建过表达的质粒载体:p CDNA3.1-lnc RNA h19;首先根据上述方法设计引物进行扩增,扩增结束后应用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,鉴定成功后构建真核表达载体p CDNA3.1-lnc RNA h19,构建完成后使用双酶切以及琼脂糖凝胶电泳再次进行确定目的基因的真实性。⑺G418筛选稳定表达A549细胞系:首先确定抗生素G418筛选浓度,然后筛选出较稳定并且过表达lnc RNAh19的细胞株A549-p CDNA3.1-lnc RNAh19,并使用real-time PCR技术来检测目的基因表达水平,以确定细胞株是否已经建立成功。⑻对于过表达的A549-p CDNA3.1-lnc RNAh19细胞株通过划痕实验来检测细胞的迁移能力,并设置阴性对照组(只转染空载体),设置空白对照组(加入转染试剂)。⑼对于过表达的A549-p CDNA3.1-lnc RNAh19细胞株通过MTT实验进行检测细胞的增殖能力,并以转染空载体的阴性对照组及仅加入转染试剂的空白对照组作为对比。⑽对于过表达的A549-p CDNA3.1-lnc RNA h19细胞株通过transwell小室实验进行检测细胞的侵袭能力,并设置阴性对照组(只转染空载体),设置空白对照组(加入转染试剂)。结果:⑴lnc RNA h19在非小细胞肺癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P0.05)⑵lnc RNA h19在非小细胞肺癌中的表达与有无淋巴结转移有关(P0.05)而与年龄、性别、有无吸烟史及肿瘤类型无相关性。⑶过表达lnc RNA h19导致非小细胞肺癌细胞的迁移、侵袭、增殖能力增加。结论:⑴lnc RNA h19在非小细胞肺癌中的表达明显高于正常肺组织,提示其与肿瘤的发生有很大的关系,并且可能发生促癌基因的作用。⑵lnc RNA h19在非小细胞肺癌中的表达与有无淋巴结转移有相关性,与年龄、性别、有无吸烟史及肿瘤类型无相关性,提示lnc RNA h19表达增高的肿瘤组织易发生淋巴结转移。⑶过表达lnc RNA h19导致细胞的迁移、侵袭、增殖性增加,提示lnc RNA h19可能成为治疗非小细胞肺癌的新的靶点。
【关键词】：非小细胞肺癌 非编码长链RNA h19 迁移 侵袭 增殖
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文缩写11-12
• 前言12
• 材料与方法12-24
• 结果24-27
• 附图27-33
• 附表33-34
• 讨论34-36
• 结论36
• 参考文献36-39
• 综述 lncRNA在非小细胞肺癌中的研究进展39-49
• 参考文献44-49
• 致谢49-50
• 个人简历50

【参考文献】

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1 熊伟民;李明峰;宋佳鸿;岳海燕;席素娟;李朝燕;;长链非编码RNA H19促进肝癌细胞增殖和侵袭[J];现代生物医学进展;2013年10期

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本文编号：626747