马铃薯内生菌的分离鉴定及抑龙葵碱功能研究

发布时间：2020-04-09 23:30

【摘要】：在贮藏过程中,马铃薯会因激素改变打破休眠期,同时伴随着内生毒素龙葵碱含量上升。在我国,由于马铃薯龙葵碱毒素而造成的产业损失高达15-20%。因此,降低块茎毒素含量,减少产业损失显得尤为重要。植物内生菌和宿主植物经过长时间的相互作用,形成了特有的基因特征和代谢产物。几乎所有高等植物体内均有内生菌的存在,内生菌可通过各种途径,如产生植物激素、调控宿主基因表达和产生其它次级代谢产物,来影响宿主植物的代谢、生长、抗逆等生理活动。目前,在农业生产中已经开始使用植物内生菌以减少无机肥料、除草剂、杀虫剂和保鲜剂的使用,从而实现农业的可持续发展。本研究以马铃薯内生菌为切入点,研究其在块茎毒素龙葵碱含量变化过程中的生物活性功能,以期寻找到具有降毒活性的内生菌株,分析其活性组分化学成分,为进一步阐明抑毒作用机制奠定基础。本研究主要内容如下:1.从马铃薯块茎中分离得到38株内生菌,其中30株放线菌分别属于11个属,包括链霉菌属(Streptomyces)、微杆菌属(Microbacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、诺卡氏菌属(Nocardioides)、谷氨酸棒杆菌属(Glutamicibacter)、节杆菌属(Arthrobacter)、壤霉菌属(Agromyces)、红球菌属(Rhodococcus)、厄氏菌属(Leucobacter)、原小单孢菌(Promicromonospora)和Paenarthrobacter属;4株变形菌分别属于4个属,包括根瘤菌属(Rhizobium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、叶杆菌属(Phyllobacterium)和申氏菌属(Shinella);4株厚壁菌分别属于2个属,包括芽孢杆菌属(Bacillus)和赖氨酸芽胞杆菌属(Lysinibacillus)。2.对上述内生菌生物学活性进行分析。采用滤纸片扩散法,筛选得到9株对马铃薯黑胫病病原菌具有抑制作用的内生菌,3株对马铃薯疮痂病病原菌具有抑制作用的内生菌,其中菌株GP5-2、HV18和NA2-14对两种病原菌均具有抑制作用。38株内生菌发酵液直接浸泡马铃薯10分钟,贮藏7天后初筛发现,内生菌株NA2-14对龙葵碱抑制作用最佳,达38%,进行16S rRNA测序鉴定,鉴定为Bacillus megaterium。将其制成菌剂,经模拟贮藏实验发现,贮藏时间越长抑制作用越明显,该菌剂可降低贮藏期龙葵碱安全风险。3.菌株NA2-14发酵液不同活性组分处理马铃薯块茎,28℃光照贮藏7天后,对块茎内生菌群进行免培养多样性分析。块茎内生菌的主要门为Bacteroidetes、Firmicutes、Actinobateria和Proteobacteria。不同龙葵碱含量块茎的内生菌群的构成存在显著性差异,菌群丰度和种类变化较大,块茎龙葵碱含量将对内生菌群的构成产生影响。同时,推测内生菌群的多样性变化可能影响其次级代谢产物的积累,进而对马铃薯龙葵碱含量产生不同的影响。4.将菌株NA2-14发酵液进行大孔树脂分离提取,活性组分20-20和40-20对马铃薯块茎龙葵碱具有较明显的抑制作用。经UPLC、UPLC-Q-TOF-MS分析,鉴定其主要化学物质为三七皂苷R6和仙茅皂苷K。
【图文】：

内生菌,大米,生长激素,幼苗

生促大米幼苗生长的内生菌及其产生的植物激素类物质（图1.1）。部分内生菌分泌的代谢产物具有调节植物根部生理状态，加快根部吸收营养成分的作用（Saravanan et al，2008）。一些内生菌可以产生和植物相同或相似的化合物：内生菌辅助植物完成化合物的合成；内生菌与宿主进行遗传信息交换，拥有相似表达通路，从而合成相同产物。Verginer （ 2010 ）等对草莓内生菌 Methylobacterium extorquens 进行研究，结果表明，Methylobacterium extorquens 体内定植浓度越高其草莓芳香越浓烈；Methylobacterium extorquens体外培养时可以产生两种草莓芳香物质。甚至有研究表明，在宿主与内生菌长期协同进化过程中，一些内生菌与宿主之间存在基因水平上的相互影响（Hardoim et al.，2015）。Passari（2016）等从

生物合成,茄碱

龙葵碱还具有抗肿瘤、抗病原菌等作用。小鼠实验证明，龙葵碱能够明显抑制其肿瘤细胞流达到延长 H22 荷瘤小鼠生存时间的目的。体外实验证明，龙葵碱对人体肝癌 HeGZ 细胞、人癌 HeLa 细胞、人神经胶质瘤 u251 细胞、人前列腺癌 Pc-3 细胞和黑色素瘤 A2058 细胞均具制作用（Lv et al.，2014； Shiro et al.，2013）。龙葵碱还具有消炎、增强血液流通、消淤散作用（马美丽，2003），以及保护肝脏、肾脏的作用（Liu et al，2004；郑岳等，2016）。在农产上，龙葵碱对病原菌具有抑制作用、对病虫害具有驱抗性以及培育抗病虫新品种（李红梅2005）。由此可知，龙葵碱不仅具有毒性作用，在医学、农业上均有广阔的潜在应用价值。.2 龙葵碱的合成路径龙葵碱在马铃薯中的合成路径的相关研究仍在进行中，已知主要合成路径如图 1.3 所示。主为三个部分：第一部分是通过甲醛戊酸途径形成萜烯类，第二部分是合成胆固醇，第三部分胆固醇合成茄碱的糖配基，也就是茄啶。其中，从乙酰辅酶 A 到合成胆固醇环节是多数植物存在的表达通路，而由胆固醇生成茄啶，再由茄啶生成茄碱和卡茄碱则是茄科类植物中特有谢路径（Ginzberg et al.，2009），，但是有关由胆固醇合成茄啶路径中的相关调控基因和酶类究尚不清晰。卡茄碱Chaconine茄碱Solanine
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS215

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