基于β-乳球蛋白的牛羊乳区别检测技术研究

发布时间：2020-04-10 01:50

【摘要】：羊乳及牛乳是两种重要的乳源,与牛乳相比,羊乳脂肪球较小,干物质含量较高,致敏性低,酪蛋白和清蛋白比例更接近人体,更利于人体消化吸收。由于羊的泌乳量小,养殖规模不大,易受到资源及季节性等因素的影响,使得羊乳的生产成本较牛乳高,致使部分商家向羊乳中掺入牛乳,损害消费者利益,干扰正常的羊乳产品市场,亟待建立快速可靠的区别检测技术。本课题通过两种电泳法研究分析牛羊乳蛋白质的差异性,以β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)为检测对象,制备多克隆和单克隆抗体,基于抗原抗体免疫反应的特异性,建立酶法及胶体金标记层析法进行牛羊乳的区别检测。其主要的研究结果如下:(1)牛羊乳β-LG的分离制备。采用HCl法沉淀酪蛋白得出1.0mol/L HCl获得的清蛋白含量高,电泳显示酪蛋白沉淀完全。确定了酸法分离乳清中β-LG最佳pH条件,牛乳pH3.9,羊乳pH 3.3。柠檬酸法比盐酸分离牛羊乳β-LG的蛋白得率增加了20%以上。在SDS-PAGE条件下,牛羊乳β-LG条带只有一个。但在非变性电泳条件下,牛乳β-LG条带2个,处于条带最下方;而羊乳中只有一条β-LG条带,位于中间位置。因此以β-LG作为特征目标蛋白,来鉴别牛羊乳。(2)牛β-LG多克隆抗体的制备及检测应用。牛β-LG免疫兔子,四免后测得血清效价达到1:20000,获得抗血清。Protein A亲和色谱纯化后,抗体纯度达到90%以上,抗体效价为1:102400,抗体无明显交叉反应,特异性好,可以用于后续的实验。建立间接酶联免疫吸附(ELISA)法分析羊乳中掺入牛乳。确定了β-LG最佳包被浓度为1:320mg/mL,羊乳中掺入脱脂牛乳最低检出量为3.5%,板内变异系数(CV)小于5%,可有效地区别牛羊乳。建立了3种基于多克隆抗体的胶体金免疫层析试纸条法。标记胶体金的最适pH值为8.0,最佳蛋白标记量为10μL。试纸条组装选择玻璃纤维素膜VL68做为金标垫,硝酸纤维素膜Sarteries CN 95作为NC膜。夹心法试纸条T线和C线用6μL,1mg/mL的β-LG-IgG和羊抗兔,可检出牛乳最低掺入量为5%。竞争法β-LG的包被量与夹心法相同,牛乳最低检出掺入量10%。双联法试纸条,在夹心法基础上增加α-CN-IgG包被检测线,可检出的牛乳最低掺入量仍为5%。在市售样本检测中,双联试纸条可避免因β-LG变性引起的假阳性,结果更加稳定。(3)牛β-LG单克隆抗体的制备及检测应用。牛β-LG免疫小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选出6株杂交瘤抗体分泌阳性细胞,分别为1B9、2D3、3A8、4G7、5E4和5F12,小鼠腹水制备单抗。其抗体效价均在1:10000以上,交叉反应小,特异性高。胶体金标记单抗后效价为1:1.28×10~5,用于建立夹心法免疫层析试纸条。优化试验条件后,用6μL,0.5mg/mL的β-LG-IgG和二抗分别包被T线和C线,可检出牛乳最低掺入量为2%,该试纸条的检测限低,特异性高,检测结果可靠稳定。牛羊乳的β-LG结构和免疫原性有差异,基于此建立免疫学检测方法用于羊乳中掺入牛乳,基于单克隆抗体的夹心法免疫胶体金试纸条方法稳定,检测速度快,交叉反应小,检测限低,适用于大规模样本的现场快速检测。
【图文】：

基于 β-乳球蛋白的牛羊乳区别检测技术研究层析试纸条法以获得最佳检测效果，，此方法的建立应对试纸条的 NC 膜，玻璃纤维素膜及金标垫进行处理，选择最优的条件进行试纸条的组装，测试试纸条的特异性，灵敏性等。将建立的胶体金免疫层析试纸条和建立的间接 ELISA 法运用到实际样品的检测中。（3）最后，为了提高检测的特异性，采用细胞工程技术制备单克隆抗体。对筛选得到的单克隆抗体的效价，特异性进行检测。并用于建立胶体金免疫层析试纸法检测牛羊乳的掺假。1.5.2 技术路线本课题的研究技术路线见图 1-4。

-乳球蛋白的分离制备乳作为最常见的营养来源，其主要蛋白分为酪蛋白、清蛋等三大类。酪蛋白和乳清蛋白是牛羊乳中主要的成分，酪。乳清蛋白包括 β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LGin，α-LA）以及乳白蛋白、乳铁蛋白（lactoferrin，LF）-LG 以二聚体的形式存在，有 A、B 两种遗传变体，在 离为单体，而我们前期研究发现，羊乳 β-LG 的非变性电白质的天然状态下，存在较大差异，选择 β-LG 为对象，检测。等电点法牛羊乳分别在 pH4.6 和 pH 4.1 下离心沉淀酪蛋用柠檬酸法进一步对牛羊乳清进行分离，得到 β-LG，作的抗体免疫新西兰大耳兔，制备获得多克隆抗体并分离纯
【学位授予单位】：陕西科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS252.7;O658.9

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本文编号：2621577