逐级pH-响应型多功能纳米载药体系对肝癌靶向联合治疗的研究

发布时间：2017-06-19 15:20

  本文关键词：逐级pH-响应型多功能纳米载药体系对肝癌靶向联合治疗的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的肝细胞癌(HCC)是临床上一种最常见的癌症,化学治疗在HCC的治疗中发挥着重要的作用,但是传统的化学治疗方法并不能有效的延长HCC患者的总生存期,这与化疗显著的毒性和耐药性是紧密相关的。因为血管生成在HCC的发展进程中起着重要的作用,因此抗血管生成被认为是一种很有前景的HCC治疗策略。本研究构建了一种逐级p H-响应的羧基化改性普鲁兰多糖(CAPL)修饰的β-聚氨基酯(PBAE)/聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米载体系统,用于化疗药物紫杉醇(PTX)和血管生成抑制剂康普瑞汀(CA4)的肝癌靶向递送,以期联合化疗和抗血管生成治疗两种方法发挥对HCC协同增效的治疗作用。内容本论文研究的内容主要分为以下三部分。第一部分为CAPL包覆的PBAE/PLGA纳米粒子(CAPL/PBAE/PLGA)的制备与表征,主要包括CAPL的合成与化学结构的表征,PBAE/PLGA与CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子的制备及其表征。第二部分为CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子的体外研究,主要包括p H-响应性、电荷翻转能力以及细胞水平的活性考察等。第三部分为CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子的体内研究,包括HCC荷瘤小鼠模型的构建、体内的组织分布考察与抗肿瘤的活性(对肿瘤细胞的杀伤作用和对肿瘤血管的抑制活性)的评价。方法1.CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子的制备与表征:以普鲁兰多糖(pullulan)为原料,通过两步化学反应制备羧基化改性普鲁兰多糖(CAPL),并利用p H滴定法、红外光谱(IR)和核磁共振氢谱(1H NMR)对其化学结构进行表征;通过乳化溶剂挥发法制备PBAE/PLGA纳米核,而后采用共孵育的方法,利用正负电荷间的相互作用实现CAPL在疏水PBAE/PLGA纳米核表面的包覆,制备CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子;通过动态激光散射法和Zeta电位分析仪检测纳米粒子的粒径分布和表面荷电性质;利用透射电镜(TEM)观察纳米粒子的结构形态。2.CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子的体外研究:通过Zeta电位分析仪检测CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子在p H 7.4,7.0与6.5的缓冲液中孵育后Zeta电位的变化,评价纳米粒子p H-响应的电荷翻转能力;制备携载生物膜荧光染料Dil的纳米粒子,并利用流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测不同p H值(7.4,7.0与6.5)的培养条件下,CAPL/PBAE/PLGA/Dil纳米粒子在人肝癌Hep G2细胞中的蓄积及胞内定位情况,评价该纳米载体的入胞能力和p H-响应性;制备载药CAPL/PBAE/PLGA/PTX和CAPL/PBAE/PLGA/CA4纳米粒子,并通过紫外分光光度法测定载药量和包封率,评价纳米载体对两种抗肿瘤药物的携载能力;采用动态透析法考察载药纳米粒子在p H 7.4,7.0,6.5和5.5缓冲液中的体外释药情况,考察纳米载体的逐级p H-响应性释药特征;利用MTT法检测CAPL/PBAE/PLGA/PTX和CAPL/PBAE/PLGA/CA4纳米粒子对Hep G2细胞和人脐静脉内皮(HUVEC)细胞的毒性;采用划痕实验考察CAPL/PBAE/PLGA/PTX和CAPL/PBAE/PLGA/CA4纳米粒子对HUVEC细胞迁移能力的抑制作用。3.CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子的体内研究:通过皮下注射Hep G2细胞构建裸鼠肝癌模型;对CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子进行Cy5.5荧光标记,利用小动物活体成像技术检测纳米粒子通过尾静脉注射给药后在荷瘤小鼠体内的组织分布情况,并以Dil作为模型药物,考察CAPL/PBAE/PLGA/Dil纳米粒子在肝、脾和肿瘤组织中的蓄积情况,综合评价纳米载体的肝癌靶向性;尾静脉注射载药CAPL/PBAE/PLGA/PTX与CAPL/PBAE/PLGA/CA4纳米粒子,考察给药后荷瘤小鼠体内肿瘤的生长情况;对治疗后小鼠的各器官组织进行病理学检查,并利用免疫组化方法检测肿瘤组织的血管生成情况,综合评价CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子携载两种药物对HCC的协同作用。结果1.成功合成了CAPL,并通过IR光谱与1H NMR波谱对其化学结构进行了确证;成功制备了CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子,其粒径大小为178.1 nm,Zeta电位值为 17.8 m V,稳定性良好,TEM观察具有典型的“核壳结构”;CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子具有电荷翻转能力,在生理p H值条件下保持稳定并带有负电性,在弱酸性条件下CAPL分子中的β-酰胺键水解游离出正电性的胺基,进而介导了PBAE/PLGA纳米核的暴露。2.CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子能够有效地携载抗肿瘤药物PTX与CA4,载药量分别为8.2%和6.9%;载药纳米粒子中PTX与CA4的体外释放均呈现显著的p H-响应性,随着释放介质p H值的降低,PTX和CA4的释放速率均显著增加;激光共聚焦和流式细胞检测数据也表明CAPL/PBAE/PLGA/Dil纳米粒子在Hep G2细胞中的蓄积具有明显的p H-选择性。载药CAPL/PBAE/PLGA/PTX与CAPL/PBAE/PLGA/CA4纳米粒子的联合给药(PTX/CA4)对Hep G2细胞和HUVEC细胞的生长具有协同增效的抑制作用,并且能够显著抑制HUVEC细胞的迁移。3.经尾静脉给药24 h后,CAPL/PBAE/PLGA/Cy5.5纳米粒子主要分布于Hep G2荷瘤小鼠的肿瘤组织中,肝脏中也有少量分布。各治疗组相比,联合给药后,PTX/CA4纳米粒子在PTX 8 mg/kg和CA4 10 mg/kg剂量下表现出对体内肿瘤生长和血管生成较强的抑制作用,并且未造成荷瘤小鼠主要器官组织的病理学变化。结论成功制备了能够对肿瘤弱酸性微环境和内涵体/溶酶体酸性条件产生逐级响应的CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子。该纳米粒子能有效负载抗肿瘤药物PTX与CA4,并且实现了两种药物的p H-响应性释放。在细胞水平,通过CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子的携载,PTX/CA4联合给药对于Hep G2细胞和HUVEC细胞的生长具有协同抑制作用,并且显著抑制了HUVEC细胞的迁移。在Hep G2荷瘤裸鼠体内,CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子表现出良好的肝癌靶向性;PTX/CA4纳米粒子联合给药后对小鼠体内肿瘤的生长和肿瘤血管的生成具有协同抑制作用。综上所述,CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子有望作为一种新型药物载体用于抗肿瘤药物的HCC靶向传递与治疗。
【关键词】：普鲁兰多糖 pH-响应 PBAE/PLGA 联合治疗 肝细胞癌
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943;R96
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 缩略语/符号说明13-14
• 前言14-17
• 研究现状、成果14-15
• 研究目的、方法15-17
• 一、CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子的制备和表征17-26
• 1.1 对象和方法17-19
• 1.1.1 材料与仪器17
• 1.1.2 实验方法17-19
• 1.2 结果19-23
• 1.2.1 AMPL和CAPL的合成与结构确证19-20
• 1.2.2 AMPL中二乙烯三胺基团取代度的测定20-21
• 1.2.3 PBAE/PLGA和CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子的制备和表征21-23
• 1.3 讨论23-25
• 1.3.1 AMPL和CAPL的合成23-24
• 1.3.2 AMPL中二乙烯三胺基团取代度的测定24-25
• 1.4 小结25-26
• 二、CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子的体外研究26-40
• 2.1 对象和方法26-28
• 2.1.1 材料与仪器26
• 2.1.2 实验方法26-28
• 2.2 结果28-36
• 2.2.1 CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子的p H-响应性电荷翻转能力28-29
• 2.2.2 CAPL/PBAE/PLGA/Dil纳米粒子在肝癌Hep G2细胞中的摄取和分布29-31
• 2.2.3 载药CAPL/PBAE/PLGA/PTX与CAPL/PBAE/PLGA/CA4纳米粒子的制备、表征及其载药与释药性能的考察31-34
• 2.2.4 载药纳米粒子在细胞水平的活性考察34-36
• 2.3 讨论36-39
• 2.3.1 CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子p H-响应和电荷翻转能力的研究36
• 2.3.2 CAPL/PBAE/PLGA/Dil纳米粒子在Hep G2细胞中的摄取和分布36-37
• 2.3.3 载药纳米粒子的制备、表征及体外释药性质的考察37-38
• 2.3.4 PTX/CA4纳米粒子的体外联合治疗作用38-39
• 2.4 小结39-40
• 三、CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子的体内研究40-48
• 3.1 对象和方法40-42
• 3.1.1 材料与仪器40
• 3.1.2 实验方法40-42
• 3.2 结果42-46
• 3.2.1 CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子在Hep G2荷瘤裸鼠中的分布42-44
• 3.2.2 CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子携载PTX与CA4治疗肝癌的体内活性评价44-46
• 3.3 讨论46-47
• 3.3.1 CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子在Hep G2荷瘤小鼠体内的组织分布46
• 3.3.2 CAPL/PBAE/PLGA纳米粒子体内抗肿瘤活性的评价46-47
• 3.4 小结47-48
• 结论48-49
• 参考文献49-54
• 发表论文和参加科研情况说明54-56
• 附录56-57
• 综述 刺激响应性肿瘤靶向纳米制剂的研究进展57-75
• 综述参考文献69-75
• 致谢75-76
• 个人简历76

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