广东湛江红树植物内生放线菌资源勘探及生物活性研究

发布时间：2017-06-25 16:13

  本文关键词：广东湛江红树植物内生放线菌资源勘探及生物活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:勘探广东湛江红树植物内生放线菌多样性,以期发现药用微生物资源,为新抗生素发现奠定基础。方法:样品经表面消毒后粉碎,采用10种分离培养基分离放线菌;采用16S rRNA基因序列分析开展初步鉴别;经液体发酵,发酵液乙酸乙酯萃取,获得提取浓缩物样品;选用白色念珠菌、罗伦隐球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的敏感菌株及部分耐药菌共14株作为检定菌,采用纸片扩散法对样品进行抗菌活性筛选;选用秀丽隐杆线虫作为模式生物,96孔板法对样品进行杀线虫活性筛选;活性菌株进行抗生素生物合成基因NRPS,PKS I和PKS II的探测。结果:从18份植物样品中共纯化到161株放线菌;它们分布于12个科的19个属:链霉菌科包括链霉菌属(Streptomyces);小单孢菌科包括小单孢菌属(Micromonospora),植物放线孢囊菌属(Plantactinospora);假诺卡氏菌科包括假诺卡氏菌属(Pseu donocardia),放线孢菌属(Actinomycetospora);地嗜皮菌科包括芽生球菌属(Blastococcus);分枝杆菌科包括分枝杆菌属(Mycobacterium);诺卡氏菌科包括戈登氏菌属(Gordonia),红球菌属(Rhodococcus),威廉姆斯氏菌属(Williamsia);微球菌科包括微菌球属(Micrococcus),考克属氏菌(K ocuria);微杆菌科包括微杆菌属(Microbacterium),短小杆菌属(Curtoba cterium);间孢囊菌科包括海藻球菌属(Phycicoccus);中村氏菌科包括中村氏菌属(Nakamurella);动孢菌科包括伪动球菌属(Pseudokineococcus)、动球菌属(Kineococcus);高温单孢菌科包括放线异壁酸菌属(Actinoallomurus);其中为优势菌属为链霉菌属。菌株IP6SC6的16S rRNA基因序列与Phycicoccus jejuensis KSW2-15T(DQ345443)的相似性为96.81%,在基于16S rRNA构建的N-J进化树上形成独立分支,为海藻球菌属的潜在新种;经形态及培养特征及16S rRNA基因序列比对排重,选取其中的88株进行发酵,有46株在至少一个抗菌活性筛选中显示为阳性,总阳性率为52.27%,其中23株具有抗G-菌活性;88株发酵液粗提物中筛选获得了27株具有良好杀线虫活性的放线菌,阳性率为30.68%,乙酸乙酯萃取物中筛选得到了19株有良好活性作用的放线菌,阳性率为21.59%;46株有活性的放线菌中,36株菌存在至少抗生素生物合成基因簇,阳性率为78.26%,其中8株同时具有3种抗生素生物合成基因簇。结论:广东湛江红树植物存在较为丰富的药用内生放线菌资源,具有从中发现放线菌新物种及新抗生素的潜力。
【关键词】：红树植物 放线菌 多样性 生物合成基因簇 生物活性
【学位授予单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R915
【目录】：

• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-13
• 英汉缩略词对照表13-14
• 前言14-23
• 参考文献19-23
• 第一章 广东湛江红树林植物内生放线菌多样性研究23-43
• 1 材料与方法23-30
• 1.1 实验材料、试剂与仪器23-27
• 1.1.1 实验材料23
• 1.1.2 主要实验试剂23-24
• 1.1.3 培养基24-26
• 1.1.3.1 分离培养基24-26
• 1.1.3.2 菌种纯化培养基26
• 1.1.3.3 菌种保藏培养基26
• 1.1.4 PCR引物26
• 1.1.5 实验仪器26-27
• 1.2 实验方法27-30
• 1.2.1 样品处理27
• 1.2.2 放线菌分离27
• 1.2.3 放线菌纯化27
• 1.2.4 菌种的保藏27-28
• 1.2.4.1 斜面保藏27-28
• 1.2.4.2 甘油冷冻保藏28
• 1.2.4.3 真空冷冻干燥保藏28
• 1.2.5 放线菌的分子鉴定28-30
• 1.2.5.1 放线菌总DNA的提取28-29
• 1.2.5.2 16S rRNA基因的PCR扩增29
• 1.2.5.3 琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应结果29-30
• 1.2.5.4 16S rRNA基因序列的测定30
• 1.2.5.5 16S rRNA基因序列比对30
• 1.2.5.6 系统进化树的构建30
• 2 结果30-38
• 2.1 菌株分离效果30-31
• 2.2 放线菌的培养特征观察和分群31-32
• 2.3 放线菌基因组DNA的提取结果32-33
• 2.4 放线菌多样性分析33-34
• 2.5 系统发育分析34-37
• 2.6 161株放线菌在培养基及植物样品中的分布37-38
• 3 讨论38-40
• 3.1 植物内生放线菌的分离38-39
• 3.2 红树林放线菌多样性39-40
• 4 结论40
• 参考文献40-43
• 第二章 广东湛江红树林植物内生放线菌抗菌杀线虫活性研究43-52
• 1 材料与方法43-48
• 1.1 实验材料、试剂与仪器43-45
• 1.1.1 实验材料43
• 1.1.2 试剂43-44
• 1.1.3 培养基44-45
• 1.1.4 缓冲液45
• 1.1.5 实验仪器45
• 1.2 实验方法45-48
• 1.2.1 放线菌发酵液及乙酸乙酯萃取液的制备45-46
• 1.2.1.1 发酵45
• 1.2.1.2 发酵液的提取及样品制备45-46
• 1.2.2 抗菌活性的筛选46
• 1.2.2.1 检定板的制备46
• 1.2.2.2 活性筛选46
• 1.2.3 杀线虫活性的筛选46-48
• 1.2.3.1 线虫的培养46-47
• 1.2.3.2 线虫的保存47
• 1.2.3.3 线虫的同步化47
• 1.2.3.4 杀线虫活性测定47-48
• 2 结果48-49
• 2.1 抗菌活性筛选结果48-49
• 2.2 杀线虫活性筛选结果49
• 3 讨论49-50
• 3.1 抗菌活性筛选49
• 3.2 杀线虫活性筛选49-50
• 4 结论50
• 参考文献50-52
• 第三章 广东湛江红树林植物内生放线菌PKS、NRPS功能基因的筛选52-58
• 1 材料与方法52-54
• 1.1 实验材料、试剂与仪器52-53
• 1.1.1 菌株52-53
• 1.1.2 试剂53
• 1.1.3 培养基53
• 1.1.4 引物53
• 1.1.5 实验仪器53
• 1.2 实验方法53-54
• 1.2.1 PKS I、PKS II和NRPS功能基因的筛选53-54
• 1.2.1.1 菌株DNA的提取53
• 1.2.1.2 NRPS、PKS I和PKS II基因的PCR扩增53-54
• 1.2.1.3 琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应结果54
• 2 NRPS、PKS I和PKS II基因筛选结果54-55
• 3 结论55-56
• 参考文献56-58
• 附录1 综述 红树林放线菌资源及其活性次级代谢产物的研究进展58-76
• 参考文献66-76
• 附录2 附表76-86
• 附表1 部分放线菌 16S rRNA比对结果76-79
• 附表2 菌株的抗菌活性筛选结果79-81
• 附表3 杀线虫活性筛选结果81-84
• 附表4 具有NRPS或/和PKS I或/和PKS II基因的菌株84-86
• 攻读学位期间发表的学术论文目录86-87
• 致谢87

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 田新莉;钟莉;成秋香;陈振华;周敏;王韬;范云;杨勇;郭鹏;夏海洋;覃重军;;从87种中草药植物中分离内生放线菌及其规律的初探[J];中国抗生素杂志;2010年09期

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本文编号：482753