多药耐药abcb4:EGFP转基因斑马鱼系的建立

发布时间：2017-07-01 21:15

  本文关键词：多药耐药abcb4:EGFP转基因斑马鱼系的建立，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:目前癌症化疗失败的主要原因是多药耐药的产生,其产生的机制则是与ATP结合盒(ATP-binding cassette,ABC)转运体家族表达增高有关。选择新型模式生物斑马鱼作为实验对象,通过阿霉素(Doxorubicin,DOX)药物暴露实验,进一步了解abcb4基因在肿瘤多药耐药中的机制。并建立Tg(abcb4:EGFP)转基因斑马鱼系,为最终建立斑马鱼药物筛选模型提供实验基础。方法:根据预实验结果,将正常发育的4~16个细胞期斑马鱼胚胎随机分为四组。分别以Eggwater,2ml/L二甲基亚砜(DMSO),10μmol DOX及含2ml/L DMSO的10μmol DOX对斑马鱼胚胎进行暴露处理,并以Eggwater处理的胚胎作为对照组。暴露处理至120hpf,收集暴露处理下的斑马鱼不同时期胚胎运用实时荧光定量PCR和胚胎原位杂交技术,检测abcb4基因在斑马鱼中的表达变化情况。同时,对abcb4基因的启动子进行预测、克隆,并通过荧光素酶活性检测对启动子进行活性测效。将具有活性的启动子,构建入Tol2-abcb4:EGFP重组质粒。通过转座子Tol2系统,建立Tg(abcb4:EGFP)转基因斑马鱼系,并运用表观分析,基因组PCR测序对其进行鉴定。结果:相较于对照组,DMOS组、DOX组以及DMSO+DOX组的斑马鱼胚胎在96,120hpf时,abcb4基因m RNA表达水平均有明显升高(p0.05),而abcb5基因m RNA表达情况则无明显变化。通过斑马鱼胚胎原位杂交,均在斑马鱼120hpf胚胎小肠部位发现有abcb4基因阳性杂交信号,且药物处理的斑马鱼胚胎在脑及心脏部位发现abcb4基因阳性杂交信号。克隆的斑马鱼abcb4基因启动子荧光素酶活性检测明显高于对照组(p0.05)。建立的Tg(abcb4:EGFP)转基因斑马鱼能在脑、小肠稳定遗传和表达绿色荧光蛋白,且基因组PCR测序正确。结论:阿霉素能诱导斑马鱼abcb4基因表达水平增高,且在心脏部位有特异性增高表现。首次发现二甲基亚砜也能诱导增加斑马鱼abcb4基因表达水平。相较于abcb5基因,abcb4基因的表达模式更近似于人类ABCB1基因。同时成功地预测、克隆出斑马鱼abcb4基因启动子,并证实了其具有驱动转录活性。以及成功建立了Tg(abcb4:EGFP)转基因斑马鱼系,为下一步abcb4基因在斑马鱼多药耐药机制中的研究,以及斑马鱼多药耐药性筛药模型的建立奠定了重要实验基础。
【关键词】：斑马鱼 多药耐药 abcb4 启动子 转基因技术
【学位授予单位】：贵阳医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R965
【目录】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-9
• 略缩词表9-10
• 引言10-14
• 材料与方法14-29
• 结果29-40
• 讨论40-46
• 结论46-47
• 参考文献47-51
• 综述51-59
• 参考文献55-59
• 作者简历59-60
• 致谢60-61
• 学位论文数据集61

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本文编号：507504