IMM-H007临床前药物代谢动力学研究

发布时间：2017-06-19 14:13

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【摘要】：IMM-H007是一种新型调血脂化合物,化学结构为腺苷类似物。药理学研究表明,IMM-H007可抑制十八烯酸诱导的脂肪性病变HepG2细胞内脂质的堆积。体内药效学研究发现,IMM-H007可降低高脂血症金黄地鼠升高的血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白和肝脏甘油三酯、总胆固醇水平。机制研究提示,IMM-H007可以上调十八烯酸诱导的脂肪病变HepG2细胞内或高脂血症金黄地鼠肝细胞内AMPK的磷酸化水平,是一种新型AMP-激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)激活剂。前期药物代谢动力学研究表明,IMM-H007在体内首先经酯酶发生水解反应,生成的水解产物M1进入细胞后经磷酸化反应生成MP(M1的5’-磷酸化产物),或发生脱氧、脱核糖环反应或Ⅱ相结合反应。由于MP的结构与内源性5’-磷酸腺苷(adenosine monophosphate, AMP)极其相似,而AMP是AMPK的有效激活剂,因此推测MP可能为IMM-H007激活靶酶AMPK的活性代谢物。由此可见, IMM-H007作为一种与他汀类药物化学结构、作用靶点和代谢途径不同的新型调血脂化合物,有望成为预防和治疗心血管疾病的新药。本研究按照临床前药代动力学研究指导原则,建立了生物样品中IMM-H007的LC-MS/MS分析方法。应用LC-MS/MS方法进行了金黄地鼠口服和舌下静脉注射IMM-H007后的体内吸收、分布、代谢和排泄的药代动力学特征研究；研究了IMM-H007与不同种属动物及人的血浆蛋白结合；鉴定了参与IMM-H007代谢的血浆酯酶及体内外主要代谢产物；探讨了IMM-H007与药物代谢酶的相互作用以及在Caco-2细胞中的转运。为揭示药物在体内的动态变化规律及种属差异,阐明药效作用的物质基础及预测潜在的药物相互作用提供实验依据。研究结果表明：1.生物样品中IMM-H007测定方法(LC-MS/MS)的建立根据临床前药代动力学指导原则,建立了生物样品中IMM-H007及代谢产物M1和MP的HPLC-MS/MS分析方法。结果表明,各检测物质在金黄地鼠全血中均未见明显基质和杂质干扰,IMM-H007、M1和MP分别在I～500、2～1000和10～5000 ng/mL浓度范围内线性关系良好。各待测物质日内和日间精密度相对标准差均小于15%,准确度在±14.2%之间。IMM-H007、M1和MP的低、中、高3个质控浓度的全血样品回收率分别为83.58～102.13%、84.29～95.27%和77.72～91.13%,基质效应为69.20-109.44%。质控样品在冰浴放置1 h、处理后样品进样池放置24 h、长期放置(-80℃放置20天)和反复冻融3次等条件下均稳定。该方法简便、可靠、灵敏度高、特异性强,可满足IMM-H007的临床前药代动力学研究。2.金黄地鼠口服和舌下静脉注射IMM-H007的体内药代动力学研究雄雌金黄地鼠单次口服IMM-H007后吸收较快,各剂量组给药后5 min血中即可检测到代谢产物M1和MP,给药后12～36 h代谢产物Ml和MP血药浓度接近检测限。各时间点原型药浓度均接近和低于检测限。雄性金黄地鼠口服不同剂量IMM-H007(50、150、450、900mg/kg)后,代谢产物M1的Cmax分别为34.18±10.46、81.95±28.28、122.6±32.9和205.8±60.0 ng/mL, T1/2分别为1.38±0.08、4.25±1.17、6.20±0.66、3.68±0.84 h,AUC(0-t)分别为143.4±13.0、412.7±121.8、991.3±232.3和2344.1±859.1μg/L*h, MRT(0-t)分别为2.81±0.18、4.20±0.64、6.75±0.95和7.50±0.97 h；代谢产物MP的Cmax分别为437.0±57.2、1122.4±271.0、1575.2±205.8和1835.9±406.6 ng/mL,T1/2分别为1.43±0.60、5.13±0.99、7.29±0.39、4.93±0.81 h,AUC(o-t)分别为2108.1±443.2、5788.8±1024.0、13248.5±2431.0和23014.6±6846.7μg/L*h, MRT(0-t)分别为3.27±0.83、5.01±0.64、7.04±0.82和8.11±0.87 h。雄鼠口服IMM-H007后全血中代谢物M1和MP的Cmax和AUC(0-t)随剂量增加而递增,MRT(0-t)随剂量增加略有延长,在50-900mg/kg剂量范围内代谢产物M1和MP在体内基本呈线性动力学过程。雌性金黄地鼠口服不同剂量IMM-H007 (50、150、450、900mg/kg)后,代谢产物M1的Cmax分别为29.84±3.09、51.39±7.95、132.4±38.9和184.9±50.4 ng/mL,T1/2分别为1.31±0.39、1.84±0.32、2.61±0.72、3.73±0.45 h,AUC(0-t)分别为72.06±15.10、294.7±101.7、1032.5±476.3和1580.3±428.0μg/L*h, MRT(0-t)分别为1.60±0.27、3.64±0.68、5.64±1.94和6.37±1.03 h；MP的Cmax分别为425.8±72.3、909.4±144.1、1894.7±395.0和2451.5±350.6 ng/mL,T1/2分别为1.21±0.06、3.54±0.64、6.70±2.70、9.65±2.79 h,AUC(0-t)分别为1307.1±268.4、5960.1±1866.5、16121.6±3884.7和24132.5±5026.8μg/L*h, MRT(0-t)分别为2.12±0.26、4.62±0.46、6.71±1.36和7.21±0.67 h。雌鼠口服IMM-H007后全血中代谢物M1和MP的Cmax和AUC(0-t)随剂量增加而递增,T1/2和MRT(0-t)随剂量增加略有延长,在50～900 mg/kg剂量范围内代谢产物Ml和MP在体内基本呈线性动力学过程,未见明显的性别差异。以M1和MP之和计算雄性金黄地鼠口服IMM-H007 (50 mg/kg)后的生物利用度为6.96%,雌性金黄地鼠的生物利用度为8.88%。雄雌性金黄地鼠口服IMM-H007 (50 mg/kg)后体内分布广泛。雄鼠给药0.25 h后原型药在各组织中浓度自高向低排序为：小肠胃附睾肌肉心脏肺脾肝肾睾丸脂肪脑全血,给药2h后原型药在各组织中浓度自高向低排序为：肌肉肺脾小肠胃脑心脏附睾睾丸肾=脂肪肝,全血中药物浓度低于最低定量限,给药8h后原型药在各组织中浓度自高向低排序为：肾脾胃附睾肝,心脏、小肠、脑、脂肪、睾丸、肌肉、肺和全血中药物浓度低于最低定量限；给药0.25 h后M1在各组织中浓度自高向低排序为：小肠胃肝脑肾心脏肺附睾脂肪附睾脾肌肉全血,给药2h后M1在各组织中浓度自高向低排序为：肝小肠脑肾胃心脏肺脾附睾全血肌肉睾丸脂肪,给药8h后M1在各组织中浓度自高向低排序为：肝脑小肠胃肾心脏脾肺附睾睾丸脂肪肌肉,全血中药物浓度低于最低定量限；给药0.25 h后MP在各组织中浓度自高向低排序为：肝全血小肠胃肾肺肌肉脾,心脏、脑、脂肪、睾丸、附睾中药物浓度均低于最低定量限,给药2h后MP在各组织中浓度自高向低排序为：全血肝脏肌肉脾,其它组织中药物浓度均低于最低定量限,给药8h后MP在各组织中浓度自高向低排序为：脾肝肌肉全血肾脑附睾,胃、心脏、小肠、睾丸、脂肪、肺中药物浓度均低于最低定量限。雌性金黄地鼠给药0.25 h后原型药在各组织中浓度自高向低排序为：小肠胃心脏卵巢肺肌肉脾子宫肾全血脂肪脑,肝脏中药物浓度低于最低定量限,给药1h后原型药在各组织中浓度自高向低排序为：胃小肠子宫卵巢心脏脾肺,脑、脂肪、肌肉、肾、肝、全血中药物浓度低于最低定量限,给药6h后原型药在除子宫外的其它组织中浓度均低于最低定量限；给药0.25 h后M1在各组织中浓度自高向低排序为：小肠胃肝肾卵巢心脏肺脾肌肉子宫脂肪脑全血,给药1h后M1在各组织中浓度自高向低排序为：肝胃小肠肾子宫肌肉心脏肺脾脂肪卵巢脾全血,给药6h后M1在各组织中浓度自高向低排序为：肝肾小肠心脏子宫脾胃肺卵巢脑,肌肉、脂肪、全血中药物浓度低于最低定量限；给药0.25 h后MP在各组织中浓度自高向低排序为：肝全血脾肺肾肌肉,其它组织中药物浓度低于最低定量限,给药1h后MP在各组织中浓度白高向低排序为：肝全血肌肉小肠肺脾肾子宫,脑、脂肪、卵巢、心脏、肾、胃中药物浓度低于最低定量限,给药6h后MP在各组织中浓度自高向低排序为：肝肺肌肉全血肾脾,脑、脂肪、子宫、卵巢、心脏、胃、小肠中药物浓度低于最低定量限。IMM-H007及其代谢产物在消化道、肌肉、心脏、肝脏、肾等组织分布较多,而在脑、脂肪、卵巢、子宫、脾、肺等组织分布较少,代谢产物M1在体内各组织中的浓度显著高于MP。雌雄金黄地鼠的组织分布趋势基本相同,无明显性别差异。雄雌金黄地鼠口服IMM-H007 (50mg/kg)后粪便和尿液中的原型药低于检测线,可检测到六种代谢产物,分别为M228、M244、M34、M404、M440和M536,其中M228、M244和M404含量较高,M536,M344和M440含量较少。给药后96h内,雄雌金黄地鼠粪、尿中六种代谢产物的总回收率为90.34%和75.03%,其中粪中的排泄量占给药量的67.70%和59.10%,尿中的排泄量占给药量的22.64%和15.93%,提示IMM-H007主要经粪排泄。3. IMM-H007血浆主要代谢产物M1与小鼠、大鼠、猴、犬和人的血浆蛋白结合IMM-H007在血浆中不稳定,可转化为代谢产物M1,因此本研究考察了代谢产物M1与不同种属动物和人的血浆蛋白结合率。实验结果表明,M1与人、食蟹猴、比格犬、金黄地鼠、SD大鼠和C57小鼠血浆蛋白的结合率均高于90%,无明显浓度依赖性,不同种属未见明显差异。4. IMM-H007体内外生物转化研究IMM-H007、M1和MP在人工胃液、人工肠液和Tris-HCl缓冲液中稳定性良好。IMM-H007和MP在体外不同种属动物和人血浆中不稳定,可水解生成M1。IMM-H007、M1和MP在体外不同种属动物和人全血中均不稳定,原型药在全血中可生成M1和MP,代谢产物M1和MP会相互转化。在体外不同种属动物和人肝微粒体中,IMM-H007和MP的转化与其在血浆中的结果一致,且不依赖NADPH,提示IMM-H007在肝微粒体中的转化不依赖CYPs。本研究应用抑制剂法对不同种属动物和人血浆催化IMM-H007水解的酯酶种类进行了初步鉴定。结果表明,金黄地鼠和大鼠血浆催化IMM-H007水解的主要酯酶为CE、Arylesterase、BChE和丝氨酸酯酶；犬血浆催化IMM-H007水解的主要酯酶为Arylesterase、BChE丝氨酸酯酶；人和猴血浆催化IMM-H007水解的主要酯酶为BChE、AChE、PON、丝氨酸酯酶和Arylesterase o前期研究结果提示,代谢产物MP是代谢产物M1在红细胞内转化生成。将M1与金黄地鼠、食蟹猴和人红细胞(人血小板)悬浮液共同温孵后,红细胞内和温孵液中有MP生成,红细胞内MP生成的量显著高于温孵液中,血小板内和温孵液中几乎检测不到MP生成,提示红细胞可能是MP生成和储存的主要场所。不同种属动物和人红细胞中MP的生成速率为食蟹猴人金黄地鼠。5. IMM-H007对金黄地鼠肝脏药物代谢酶的诱导和抑制作用IMM-H007(50μM)对SD大鼠、金黄地鼠、食蟹猴和人肝微粒体CYP3A2/4、 CYP1A2、CYP2C6/9、CYP2D6、CYP2E1、CYP2C11/19酶活性无明显抑制作用。金黄地鼠口服IMM-H007(50 mg/kg)每日一次连续七日后,对肝CYPs主要同工酶活性无明显诱导和抑制作用。6. IMM-H007经Caco-2细胞的转运IMM-H007和代谢产物M1在Caco-2细胞的转运具有方向性,提示IMM-H007可能为P-gp的底物。
【关键词】：IMM-H007 药代动力学 生物转化
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R969.1
【目录】：

• 缩略词表5-7
• 摘要7-11
• Abstract11-17
• 前言17-19
• 第一节 生物样品中IMM-H007测定方法(LC-MS/MS)的建立19-36
• 1. 实验材料19-20
• 2. 实验方法20-23
• 3. 实验结果23-35
• 3.1 专属性23-27
• 3.2 线性范围和灵敏度27-30
• 3.3 精密度与准确度30-32
• 3.4 回收率32
• 3.5 基质效应32-33
• 3.6 稳定性33-35
• 4. 讨论35-36
• 第二节 金黄地鼠口服和舌下静脉注射IMM-H007的体内药代动力学研究36-62
• 1. 实验材料36
• 2. 实验方法36-37
• 3. 实验结果37-60
• 3.1. 金黄地鼠口服IMM-H007后的全血药代动力学37-46
• 3.2. 金黄地鼠舌下静脉注射IMM-H007后的全血药代动力学及生物利用度46-49
• 3.3. 金黄地鼠口服IMM-H007后体内各主要脏器和组织的分布49-57
• 3.4. 金黄地鼠口服IMM-H007后自粪便、尿液的排泄57-60
• 4. 讨论60-62
• 第三节 IMM-H007在血浆中主要代谢产物与人、食蟹猴、比格犬、金黄地鼠、SD大鼠、C57小鼠的血浆蛋白结合62-65
• 1. 材料62
• 2. 实验方法62-64
• 3. 实验结果64
• 4. 讨论64-65
• 第四节 IMM-H007体外生物转化研究65-92
• 1. 材料65
• 2. 实验方法65-70
• 3. 实验结果70-90
• 3.1. IMM-H007在金黄地鼠体内生物样品代谢产物鉴定70-74
• 3.2. IMM-H007及其代谢产物的体外稳定性74-85
• 3.3. 不同种属血浆中IMM-H007转化为M1的酯酶归属85-86
• 3.4. 不同种属动物和人红细胞中MP的生成86-90
• 4. 讨论90-92
• 第五节 IMM-H007对金黄地鼠肝脏药物代谢酶的诱导和抑制作用92-102
• 1. 材料92
• 2. 实验方法92-94
• 3. 实验结果94-100
• 3.1. IMM-H007体外对SD大鼠、金黄地鼠、食蟹猴和人肝微粒体CYPs的抑制作用94-99
• 3.2. IMM-H007口服给药对金黄地鼠肝微粒体CYPs的诱导作用99-100
• 4. 讨论100-102
• 第六节 IMM-H007经Caco-2细胞的转运102-107
• 1. 材料102-103
• 2. 实验方法103-105
• 3. 实验结果105
• 4. 讨论105-107
• 结论107-108
• 参考文献108-111
• 附录111-112
• 致谢112-113

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本文编号：462771